组培消毒常用试剂 灭菌及无菌操作

植物组织培养成败的关键：保证无菌，避免污染。

器皿和用具的洗涤（P28）：玻璃器皿洗涤方法：先用碱洗，即用肥皂粉刷洗，用清水清洗，晾干。

难洗的器具：需用铬酸-硫酸混合洗涤液浸泡，浸泡后用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。

 培养基灭菌及培养基、植物材料的消毒

（一）培养基的灭菌（高压灭菌）

一般程序：

1.按实验需求配制……

2.……加水，防止干烧。

3.将培养基瓶，所用的培养皿，接种用的器具，蒸馏水等需要灭菌的东西放入锅内。

4.关上锅盖，拧紧。

5.打开电源，开始加热，至100℃，3~5min。

6.灭菌锅自动关上排气阀，开始加压，温度继续上升，温度到达121℃。

7.维持此温度，压力维持0.1~0.2MPa下，保持10-20分钟。

8.时间到后自动降压降温至100℃，压力为零。

9.在94℃时切断电源，可打开锅盖，取出培养基冷却，灭菌完毕。

灭菌最少时间：

注意事项：①在灭菌之前一定要检查锅中的水位，严禁干烧，以免造成事故。

②灭菌前还需检查排气阀是否关上。

③只有当锅中压力为零时才能打开锅盖，否则会有危险。

④锅内应留有空隙，不能太满。

⑤灭菌时间不宜过长，也不可以超过灭菌锅规定的压力范围。

（二）物体表面灭菌

灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌。

范围：桌面、墙面、双手、材料表面。

消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；0.25-1%新洁尔灭，洗衣粉；吐温-80。

（三）接种工具灭菌

用前干热灭菌 160-180℃，1.5-2.0h

用前湿热灭菌 121℃，20-30min

接种前用酒精棉球檫试，侵入95%酒精液中，并在酒精灯上灭菌。

（四）实验服、口罩、滤纸灭菌

湿热灭菌 121℃，20-30min

……

（五）接种室灭菌

紫外灯照射（接种室、超净台、接种箱）：波长260nm，距离小于1.2m，2.-30min。

臭氧灭菌机：1~2h。

熏蒸灭菌：5-8mL/m3甲醛+5g/m3高锰酸钾；冰醋酸。

接种台喷雾消毒：75%酒精。

（六）培养室灭菌

新建培养……

隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地一次，用高锰酸钾擦。

无菌操作

灭菌：用物理或化学方法，杀死物体表面积和孔隙内一切微生物或生物体，即所有有生命的物质全部杀死。

消毒：杀死、

消除或抑制部分微生物，使之不发生作用。

常用化学消毒剂： 

酒精灭菌的原理：

1) 酒精具有较强的穿透能力和杀菌力，它使细菌蛋白质变性。使用的浓度一般为70—75%。

2) 处理时间15—30s，不宜太久，因此细胞容易收缩脱水。它具有浸润和灭菌双重作用，适用于表面消毒；

3) 在乙醇溶液中加入0.1%的酸或碱，可提高杀菌效果。

植物材料消毒程序：1）清洗（流动自来水冲洗数小时，洗衣粉毛刷等清洗）；2）灭菌剂浸泡灭菌；3）无菌水清洗4、5次擦干；4）加表面活性剂（吐温-20或吐温-80，加强表面活性剂，磁力搅拌，超声振荡）。

常规二次消毒法：材料先放入70%的乙醇中，约30s后再在0.1%的氯化银中浸泡，2—0min，或在2%次氯酸钠中浸泡20min,然后用无菌水冲洗3、4次。

广谱实验法

在广谱试验中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机物质、生长素、细胞分裂素

4类物质各3种浓度的自由组合即构成了3项包括81个处理的实验。

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